肺纤维化疾病由于缺乏可靠的生物标志物进行风险分层和治疗监测，给疾病的精确管理带来挑战。近年来发现，单核细胞来源的巨噬细胞(MDMφ)的积累是促进肺纤维化的关键因素。因此，跟踪MDMφ积累的体内动力学可望用于肺炎纤维化的评估。

为研究CMKLR1在IPF肺免疫细胞中的作用，作者对两个具有>300,000个免疫细胞的全肺单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据集进行探索分析。按不同表型，巨噬细胞被分为包含Alv-Mφ (FABP4Hi)和FABP4Int-Mφ的肺泡巨噬细胞，以及3组非肺泡巨噬细胞：SPP1- m φ组、FOLR2-Mφ组及罕见的OLFML3-Mφ群体。

两个数据集中，CMKLR1表达在巨噬细胞群体中最常被检测到(图1C、D)。FOLR2-Mφ在所有免疫细胞类型中具有最高的检测频率及CMKLR1表达，其次是OLFML3-Mφ， SPP1-Mφ等。

与更严重的下肺叶相比，IPF上肺叶中促纤维化SPP1+巨噬细胞更少。但CMKLR1+巨噬细胞数量在上、下肺叶中同样具有显著升高（IPF上肺叶：8.4%，下肺叶：8.9%；对照组上肺叶：2.3%，下肺叶：0.8%），相比于终末期SPP1+促纤维化巨噬细胞的升高，可作为更可靠的早期生物标志物。

广义加性模型(GAMs)显示，在FOLR2-Mφ和SPP1-Mφ轨迹中，CMKLR1的表达随着单核细胞特征的下降而上升，当促纤维化基因表达开始时达到峰值，后随着促纤维化特征的上升逐渐下降（图1I、J）。表明CMKLR1是新生MDMφ在肺纤维化中富集的标志，可随着巨噬细胞适应纤维化微环境并逐渐下降。

图1. 人类肺部疾病和健康的scRNA-seq分析。(B)按细胞类型标记的细胞UMAP。(C-D) 细胞类型、数据集及疾病间标准化的基因表达UMAP和热图。(I- J) 基因表达的广义加性模型(GAM)拟合为上述每条轨迹的扩散伪时间函数。

博莱霉素气管给药后的1、2和4周分别大致对应于肺炎高峰期、持续肺炎的早期ECM重构及炎症消退伴纤维化。为便于流式细胞实验，作者用荧光修饰肽（6CF-CG34）替代NODAGA，合成PET示踪剂[⁶⁴Cu]NODAGA-CG34的类似物。结果显示，基线期的主要免疫细胞群体为组织驻留的肺泡巨噬细胞，MDMφ忽略不计。1周后， MDMφ显著积累，而肺泡巨噬细胞数量稳定。第2周，MDMφ数量与1周时相似，但后者数量大幅增加，且MDMφ表现出与其愈加相似的表型分化（图2A）。4周后均回落至基线水平。在此期间，肺单核细胞数量相对稳定。   

图2. 流式细胞术鉴定驱动CMKLR1靶向肽摄取的细胞。(A)肺泡巨噬细胞、间质巨噬细胞和MDMφ的鉴定。(B)单核细胞和巨噬细胞亚群绝对数量的动力学。(D)单核细胞和巨噬细胞群体对6CF- CG34特异性摄取的定量检测。(E)给药后摄取6CF- CG34的细胞亚群占比。

相应地，最初2周的MDMφ对6CF-CG34的摄取很高，第4周趋于减少（图2C、D）。间质巨噬细胞仅在给药后1周有短暂增加，2周后又恢复至基线水平。而肺泡巨噬细胞和单核细胞在此期间均无显著的6CF-CG34特异性摄取。NK细胞尽管具有显著摄取，但博来霉素诱导损伤后，其丰度及CMKLR1表达均未变化。

此外，在损伤后1周和2周，6CF-CG34的总摄取显著增加，且主要由MDMφ的积累驱动（78%和86%）。4周后降至基线水平，显示了MDMφ丰度及其CMKLR1表达水平的降低。[⁶⁴Cu]NODAGA-CG34 PET及体外γ计数均得到与上述的一致结果。

为验证[64Cu]NODAGA-CG34 PET提供的CMKLR1巨噬细胞浸润的炎性肺组织空间图的准确性，作者随后对肺部进行磷屏成像（Sapphire激光扫描系统拍摄），并对CMKLR1和巨噬细胞标志物F4/80进行免疫荧光染色(图5)。体内PET检测的示踪剂摄取与相应的离体磷屏成像之间存在强大的共定位(图5A、B)，证实了示踪剂摄取的无创空间定位的准确性。[⁶⁴Cu]NODAGA-CG34摄取高的区域与表达CMKLR1的F4/80+巨噬细胞丰富的炎症区域相对应(图5C、D)。可见，[⁶⁴Cu]NODAGA-CG34 PET可定量监测博莱霉素诱导的纤维化肺损伤各阶段MDMφ募集的空间定位。

图5. 博莱霉素处理小鼠1周后， CMKLR1巨噬细胞浸润的炎性肺区[⁶⁴Cu]NODAGA-CG34摄取共定位图像(A) PET/CT(B)体外放射自显影（磷屏成像，Sapphire激光扫描成像系统拍摄）(C)苏木精和伊红染色和(D)免疫染色组织

进一步纵向研究显示，第1周肺中[⁶⁴Cu]NODAGA-CG34高摄取的区域与第4周CT检测到的严重纤维化的区域相对应，且摄取量与纤维化程度（羟脯氨酸含量及肺衰减量）相关。而第1周的CT实变与纤维化程度仅为弱相关或不相关。可见，肺损伤早期[⁶⁴Cu]NODAGA-CG34的摄取可准确预测纤维化严重程度和分布，有效补充CT获得的解剖学信息。

图6. [⁶⁴Cu]NODAGA-CG34 PET对早期肺纤维化的预测。肺部[⁶⁴Cu]NODAGA-CG34摄取与第四周羟脯氨酸含量(C)及肺衰减 (D)相关。第1周的CT实变与第4周羟脯氨酸弱相关(E)，与肺衰减无显著相关(F)。

对三个地点的IPF患者纵向队列二次分析显示，与对照组相比，IPF患者支气管肺泡灌洗（BAL）细胞中的CMKLR1表达更高，且呈现明显的异质性。转录组分析显示，CMKLR1高表达患者中，趋化因子/趋化因子受体（如CCL2、CCL7）、细胞因子/细胞因子受体（如IL1R2、IL12RB2）及ECM重塑等炎症相关基因表达上调（图7B），或可助于识别IFP不同炎症内型。

CMKLR1表达具有作为预后生物标志物的潜力，与年龄、性别、研究地点和GAP（性别-年龄生理学）指数无关。CMKLR1表达越高，预后逐渐恶化。

此外，在不同水平GAP指数的患者分层中，CMKLR1表达均显示与生存率的相关性。ROC分析显示，CMKLR1在短期至中期随访期间的预测能力优于GAP评分，可望提供现有临床工具外更丰富的风险分层信息。

图7. CMKLR1高表达可识别炎症性和预后不良的IPF内型。(D)基于CMKLR1表达的Kaplan-Meier生存曲线。(E、F) GAP评分分层后的Kaplan-Meier生存曲线表明，CMKLR1高表达预示着较差的生存。(G、H) CMKLR1表达及GAP评分预测BAL术后死亡率的ROC曲线。

作者利用现有的生物库进一步探索分析，发现IPF、结节病、硬皮病、类风湿关节炎和煤矿工人尘肺患者肺中存在表达CMKLR1的白细胞，提供了CMKLR1在各种纤维化肺疾病中表达的组织学证据。但由于移除的肺通常代表终末期的疾病特征，仍需进一步研究来阐明CMKLR1在这些疾病中的特异性表达，及其用于疾病内分型和风险分层的潜在用途。

本研究建立了CMKLR1作为纤维化肺病中富集MDMφ的生物标志物，证明了CMKLR1靶向PET无创监测MDMφ积累和纤维化程度预测的准确性，并显示出其对IPF分子内分型的应用前景。

原文链接：

https://www.science.org/doi/full/10.1126/sciadv.adm9817

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