文献解读 | 数字PCR快速灵敏鉴别脓毒症病原体发表时间：2024-07-08 16:16
近日，浙江大学医学院附属第一医院呼吸危重症科基于领航数字PCR血流感染解决方案发表文章，揭示相比于血培养，数字PCR在疑似脓毒症患者病原诊断方面，有更高灵敏性和更快时效性。定量结果与CRP及PCT趋势基本一致，表明其可用于脓毒症患者动态监测。 题目: Sensitive and rapid identification of pathogens by droplet digital PCR in a cohort of septic patients: a prospective diagnostic study 期刊: Infectious Diseases 单位: 浙江大学医学院附属第一医院 发表时间: 2024年5月 研究背景 
脓毒症/脓毒性休克是重症患者死亡的主要原因之一，早期充分的抗生素治疗是改善患者预后的关键，成功的抗菌治疗首先取决于对病原微生物的快速准确诊断。尽早获得病原微生物的鉴定及其耐药性信息已成为早期合理使用抗菌药物的关键因素。
液滴数字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)具有超高灵敏度、绝对定量、独立于标准曲线和高稳定性等特点。在传染病领域，利用ddPCR的超高敏感性和绝对定量能力，可以实现外周血中病原微生物DNA的快速检测。然而，目前还没有足够的证据和研究表明ddPCR在重症监护室疑似脓毒症患者中的应用和有效性。
本研究旨在调查ddPCR在重症监护病房疑似脓毒症患者中鉴定病原体的诊断效力。目标是找到一种方法，可以快速诊断重症监护病房中脓毒症患者的致病微生物和耐药性信息，从而改善预后。 研究方法
采集患者样本进行血培养(blood culture, BC)和ddPCR检测，并通过Sanger测序进行验证。
 表1：ddPCR检测Panel
研究结果
研究共纳入了89名患者的100例脓毒症病例，符合条件的患者的临床特征如表2所示。共有24份样本的血液培养(BC+)结果呈阳性。在这24株BC+菌株中，有3株不在ddPCR检测范围内，分别是洋葱伯克霍尔德菌、泛成团菌和沃氏葡萄球菌。在剩余的21株BC+菌株中，有18株被ddPCR检测到。
在76例血培养(BC-)阴性病例中，29例ddPCR未检测到任何菌株(ddPCR-)，而47例ddPCR检测到菌株(ddPCR+)。在这47例BC-/ ddPCR+样本中，23例高度疑似脓毒症(probable sepsis)，24例疑似脓毒症(possible sepsis)。表3介绍了23例高度疑似脓毒症病例的病原体和其它体液培养。对于24例疑似脓毒症，重新提取了样本进行第一代测序。第一代测序结果显示，13个样本与ddPCR检测结果一致，11个样本不一致（图2）。
表3：高度疑似脓毒症患者的病原体和其它体液培养
图2：患者登记和结果分析流程图
血培养阳性率为24.0%(24/100)，ddPCR阳性率为65.0%(65/100)。除去ddPCR未涵盖的3份BC+样本，其余21份BC+样本中检测到的病原体分布如图3所示。在21个BC+样本中，肺炎克雷伯菌(n=5)的流行率最高，其次是粘质沙雷氏菌(n=3)、奇异变形杆菌(n=3)和粪肠球菌(n=3)。在65份ddPCR+样本中，共鉴定出112株菌株，检测到的病原体分布见图 3。肺炎克雷伯菌的检出率最高(n=24)，其次是大肠埃希菌(n=16)和粪肠球菌(n=13)。
图3：ddPCR和血培养检测病原体分布
在BC-/ddPCR+样本中，有23个病例被确定为高度疑似脓毒症。进一步的亚组分析显示，在G+BC-/ddPCR+亚组中，21例高度疑似脓毒症样本与革兰氏阳性球菌(G+)有关，而G-BC-/ddPCR+亚组包括32例高度疑似脓毒症样本与革兰氏阴性杆菌(G-)有关。 在对ddPCR的诊断性能进行全面评估后发现，与血培养相比，ddPCR 在脓毒症诊断方面总体灵敏度为75.0%，特异性为69.7%。对于与革兰氏阳性球菌相关的脓毒症病例，ddPCR 的灵敏度为100%，特异性为88.4%。对于与革兰氏阴性杆菌相关的脓毒症，ddPCR 的灵敏度为 66.7%，特异性为75.6%。值得注意的是，与血培养相比，ddPCR 的检出率相对较高(41% [41/100] VS 24% [24/100]，x²=6.587；p=0.01)，因此脓毒症病例的总体检出率提高了17%(表 4)。  表4：ddPCR与BC诊断性能比较 此外，还比较了ddPCR和血液培养检测时间。ddPCR整个检测过程通常只需2-3小时即可完成。研究记录了24份血培养阳性样本从微生物部门收到样本到获得药敏结果的处理时间，中位时间为47.5小时(IQR，42-62.25 小时)。虽然ddPCR的具体检测时间无法精确确定，但由于ddPCR检测程序根据制造商的规程进行了约2.5小时，可以观察到血培养的中位周转时间长于ddPCR。
如图4所示，根据患者是否接受了经验性抗生素治疗对样本进行了分类，并比较了经验性抗生素治疗对ddPCR诊断性能的影响。在经验性抗生素治疗组，ddPCR的脓毒症检出率为46.2%(24/52)，与非经验性抗生素治疗组的 37.5%(18/48)无统计学差异(x² = 0.767；p=0.381)。  图4：根据是否进行经验性抗菌治疗绘制的患者流程图 进一步比较了两组ddPCR的灵敏度和特异性，发现与血培养相比，经验性抗生素治疗组中ddPC 诊断脓毒症的灵敏度为78.6%，特异性为65.8%。在非经验性抗生素治疗组，ddPCR的灵敏度为80.0%，特异性为73.7%(表5)。经验性抗生素治疗对ddPCR诊断的灵敏度和特异性没有明显影响(分别为 78.6% vs 80.0% 和 65.8% vs 73.7%；P> 0.05)。
图5：经验性抗菌治疗对ddPCR定量结果的影响
在研究中，ddPCR检测了三种临床上最常见的耐药基因: blaKPC、mecA和blaNDM。如表6所示，在13个样本中检测到了耐药性基因。其中，6个样本检测到blaKPC，1个样本检测到blaNDM。进一步分析发现，只要ddPCR检测到耐碳青霉烯酶基因blaKPC或blaNDM，它们就与患者血液或血外样本中培养的耐碳青霉烯酶革兰氏阴性菌相对应。在7份样本中检测到mecA基因。在6、53和94号样本中，耐药基因与药敏试验结果相符。在第40个样本中，只检测到mecA基因，而ddPCR检测未发现细菌种类。  表6：ddPCR检测到的AMR基因以及通过血培养和所有微生物检测检测到的相关病原体。
为了解ddPCR定量检测能力在脓毒症动态监测中的价值，对6名血培养阳性患者(编号1、27、31、32、74、84)进行了ddPCR动态监测。最初血培养和 ddPCR检测均呈阳性的患者在第3天和第6天再次接受血液监测。将检测到的病原体拷贝数与临床相关感染指标(包括白细胞计数、C-反应蛋白和降钙素原)进行了比较。可以看出，ddPCR的定量结果与C反应蛋白和降钙素水平的趋势基本一致。不过，与白细胞计数的变化趋势相比，两者之间存在差异(图6)。
图6：ddPCR在脓毒症动态监测中的价值 结论 与血培养相比，ddPCR对疑似脓毒症患者的病原体诊断具有更高的灵敏度，并能在短时间内提供病原体和耐药性信息。ddPCR 的定量结果与C反应蛋白和降钙素原水平的变化趋势基本一致，表明ddPCR可作为脓毒症患者病原体负荷的动态监测工具。要想更全面地了解其临床价值，还需要进行更大规模的多中心研究。 END 转载自领航基因 |
